一種用于無細胞蛋白質連續合成的裝置和方法與流程

文檔序號:18799142發布日期:2019-09-29 20:24
一種用于無細胞蛋白質連續合成的裝置和方法與流程

本發明屬于生物反應系統技術領域,尤其涉及一種用于無細胞蛋白質連續合成的裝置和方法。



背景技術:

近年來,無細胞蛋白合成(cell-free protein synthesis,CFPS)作為一種新型的蛋白質合成方法,展現出巨大的潛力和應用前景。該蛋白質合成系統的主要組分包括具有基本轉錄和翻譯功能的粗提取物、DNA模板、能量再生物質、輔因子和無機鹽等。特別地,與自然狀態下活細胞合成蛋白質不同,無細胞蛋白合成體系發生在一個開放的世界,不受細胞膜的限制,這不僅允許無細胞蛋白體系合成對細胞活性有害的蛋白質,還使基因更容易被編輯和蛋白質合成過程更好監控,極大地增加了蛋白質合成過程的靈活性。因此,無細胞合成體系具有比活細胞合成方法更快的蛋白質表達率、更高的蛋白質產量和可合成更復雜的蛋白質。

目前,已有多種反應器被應用于無細胞蛋白質合成過程。間歇式反應器由于操作簡單、規模小,在無細胞合成中得到了廣泛的應用。氧氣作為三磷酸腺苷(ATP)再生系統中的關鍵組分,對ATP的再生過程有著重要的影響。氧供應不足降低ATP再生速率,增加脫氧核糖核酸(DNA)轉錄-翻譯時間,從而降低蛋白質產量和合成效率。同時,蛋白質合成過程中產生的二氧化碳也可能抑制代謝過程,影響蛋白質表達。因此,無細胞合成過程中氣體的擴散速率影響了蛋白質的產量和合成速率。然而,間歇反應器氣液傳質性能差,放大困難,將會降低了蛋白質的產量和表達率,同時,該過程操作繁瑣,限制了其在無細胞蛋白質合成中的應用。而微反應器作為一種新興的反應器,以其良好的傳質性能和過程連續可控等優點受到研究者的廣泛關注,具有傳質距離短,合成過程連續,比間歇反應器蛋白質產率高等優點。本專利提出的微型套管膜反應器用于無細胞蛋白質合成過程,除了具有傳統微反應器特點外,還可以把氣體和反應底物分隔開,避免氣體和反應底物的直接接觸,氣體濃度和反應底物流量可以隨時進行改變。該反應器用于無細胞蛋白質合成具有靈活和高效的特點,可實現蛋白質的按需合成。



技術實現要素:

發明要解決的技術問題

本發明的目的是利用微型套管膜反應器的高透氣性提高氣體傳質速度,精準地控制無細胞合成過程中的氣體濃度和流量,并結合連續流動合成的方式,實現無細胞蛋白質的靈活、高效和按需合成。同時,通過合成抗體、類病毒顆粒、抗菌肽和疫苗等四種代表性的蛋白質,證明該蛋白質合成方法的普適性。

用于解決技術問題的方法

針對上述問題,本發明提出了一種用于無細胞蛋白連續合成的裝置和方法。

根據本發明的一個實施方案,提供一種用于無細胞蛋白質連續合成的裝置,其包括:液體提供單元、氣體提供單元、微型套管膜反應單元、控溫單元、和蛋白質純化單元。液體提供單元、氣體提供單元、蛋白質純化單元分別與微型套管膜反應單元連接,控溫單元控制微型套管膜反應單元的反應溫度,蛋白質純化單元純化微型套管膜反應單元排出的反應產物。

一種實施方式為,所述液體提供單元采用液體輸送泵輸送液體,液體輸送泵選自注射泵、平流泵、蠕動泵或其他可以精準控制流速的泵。

一種實施方式為,液體提供單元將液體反應原料輸送到套管膜反應單元中,套管膜反應單元所用膜為中空纖維膜,液體反應原料在中空膜中反應。

一種實施方式為,套管膜反應單元中中空纖維膜的根數為1根或者多根,中空膜內徑為0.1~2mm,膜厚為0.05~0.5mm,膜長度為0.5~10m。

一種實施方式為,套管膜反應單元所用膜材料為聚丙烯、聚四氟乙烯、聚 4-甲基1-戊烯(PMP)、Teflon AF 2400、Teflon AF1600、聚砜或者其他透氣疏水膜材料。

一種實施方式為,氣體提供單元將氣體原料輸送到套管膜反應單元中,氣體在套管膜反應單元與膜材料之間的空隙中流動,并從套管膜反應單元排出。

根據本發明的一個實施方案,提供一種用于無細胞蛋白質連續合成的方法,其特征在于,使用了如權利要求1-6中任一項所述的裝置,包括如下步驟:

(1)利用微型套管膜反應單元進行無細胞蛋白質連續流動合成,通過液體提供單元將反應底物連續注入膜反應單元內的中空纖維膜管中進行蛋白質表達,通過氣體提供單元向微型套管膜反應單元中提供氣體,反應溫度通過溫度控制單元控制;

(2)反應底物在套管膜反應單元中表達一定時間后,得到的產物直接流入蛋白質純化單元進行蛋白質純化,得到純化好的蛋白質;

一種實施方式為,所述步驟(1)中控制溫度為0-60℃。

一種實施方式為,所述步驟(1)中停留時間為0.1-24h。

一種實施方式為,所述步驟(1)中膜反應單元殼層氣體中氧氣體積分數為 0-100%,其余氣體組分為氮氣。

本發明的有益效果

在本發明提供的一種用于無細胞蛋白質連續合成的裝置和方法中,蛋白質合成效率高且合成速度快;套管膜反應單元中蛋白質表達時間比微型離心管少了1-6h,但表達量比微型離心管中高了0-5mg/mL;氣體傳質速度快,由于管表面上高透氣性致密膜,氧氣快速地進入反應底物,從而可以精準的控制氧氣在蛋白質合成過程中的濃度,同時,可以迅速將反應底物中的二氧化碳脫除;易于集成蛋白質純化等多個步驟,實現蛋白質連續高效合成;具有很好的普適性和生物相容性,可以快速高效合成抗體、疫苗、類病毒顆粒和抗菌肽等四種代表性的蛋白質。

從以下示例性實施方案的描述中,本發明的進一步特征將變得顯而易見。

附圖說明

圖1是本發明實施例中微型套管膜反應單元內連續合成蛋白質的流程圖;

圖2是本發明實施例中微型套管膜反應單元內合成抗體、類病毒顆粒、疫苗和抗菌肽等四種代表性蛋白質的電泳圖。

具體實施方式

以下對本公開的一個實施方式具體地說明,但本公開并非限定于此。

本發明提供一種無細胞蛋白質快速高效合成的裝置和方法。該裝置包括液體提供單元、氣體提供單元、微型套管膜反應單元、控溫單元、和蛋白質純化單元。液體提供單元、氣體提供單元、蛋白質純化單元分別與微型套管膜反應單元連接,控溫單元控制微型套管膜反應單元的反應溫度,蛋白質純化單元純化微型套管膜反應單元排出的反應產物。該使用該裝置制備蛋白質的方法,基于微型套管膜反應單元中中空纖維膜對氣體的高透氣性,氧氣可以迅速透過膜進入液體管路中連續流動的反應底物,參與底物的蛋白質表達過程,同時代謝產生的二氧化碳可以通過膜快速地從流動底物中去除,表達溫度由恒溫水浴槽控制,氧氣流量和濃度由氣體質量流量計控制。

液體提供單元將液體反應原料輸送到套管膜反應單元中,液體提供單元采用液體輸送泵輸送液體,液體輸送泵選自注射泵、平流泵、蠕動泵或其他可以精準控制流速的泵。

套管膜反應單元所用膜為中空纖維膜,液體反應原料在中空膜中反應。套管膜反應單元中中空纖維膜的根數為1根或者多根,中空膜內徑為0.1~2mm,膜厚為0.05~0.5mm,膜長度為0.5~10m。套管膜反應單元所用膜材料為聚丙烯、聚四氟乙烯、聚4-甲基1-戊烯(PMP)、Teflon AF 2400、Teflon AF1600、聚砜或者其他透氣疏水膜材料。

氣體提供單元將氣體原料輸送到套管膜反應單元中,氣體在套管膜反應單元與膜材料之間的空隙中流動,并從套管膜反應單元排出,氣體在本申請中采用氧氣,采用氣體質量流量計控制氣體流量。相應的,可以設置氣體收集單元。

溫度控制單元可以采用常規的溫度控制裝置,可以使用例如恒溫水浴等。在反應底物在套管膜反應單元中表達的同時,在同一溫度條件下(例如在同一水浴鍋內),將0-50μL反應物加入到微型離心管中進行蛋白質表達,作為對照組實驗,分析微型套管膜反應單元中蛋白質合成效率。

實施例1:

通過注射泵將合成熒光蛋白質的反應底物連續注入套管膜反應單元的液體管路管中,改變反應底物的流速0-500μL/min,使反應底物在反應器內中的停留時間為0-6h,在反應器殼層中以40mL/min充入氧氣體積分數為21%氣體混合物,反應溫度維持在30℃。

在表達一定時間后,生成的產物進入蛋白質純化柱中。經純化后,得到純化好的蛋白質產品。

在純化柱出口,取20μL蛋白質樣品;同時,從恒溫水浴槽中取出微型離心管中的樣品,都放入-80℃冷凍冰箱,淬滅反應。

將得到的樣品解凍,進行電泳實驗,分析并得到不同停留時間下蛋白質的表達量,如表1。

實施例2:

通過平流泵將合成熒光蛋白質的反應底物連續注入套管膜反應單元的液體管路中,改變反應底物的流速100μL/min,使反應底物在反應器中的停留時間為6h,在反應器殼層中以40mL/min充入氧氣體積分數為0%、21%和100%的氣體混合物,反應溫度維持在30℃。

生成的產物從套管膜反應單元的內管出口直接流入蛋白質純化柱中進行純化。經純化后,得到純化好的蛋白質產品。

在純化柱出口,取20μL蛋白質樣品放入-80℃冷凍冰箱儲存。

將得到的樣品解凍,進行電泳實驗,分析得到在氧氣濃度為0%、21%和100%氣體混合物下蛋白質的表達量依次為0mg/mL、10.9mg/L和5.7mg/mL。

實施例3:

通過蠕動泵將合成熒光蛋白質的反應底物連續注入套管膜反應單元的液體管路中,改變反應底物的流速100μL/min,使反應底物在反應器內中的停留時間為6h,在反應器殼層中以40mL/min充入氧體積分數為21%的氣體混合物,反應溫度維持在20℃、30℃和37℃。

在表達一定時間后,生成的產物進入蛋白質純化柱中。經純化后,得到純化好的蛋白質產品。

在純化柱出口,取20μL蛋白質樣品,放入-80℃冷凍冰箱。

將得到的樣品解凍,進行電泳實驗,得到反應溫度在20℃、30℃和37℃下,蛋白質的表達量依次為0.9mg/mL、10.3mg/mL和6.9mg/mL。

實施例4:

通過注射泵將反應底物連續注入套管膜反應單元的液體管路中,改變反應底物的流速100μL/min,使在反應器內中的停留時間為6h,在反應器氣體殼層中以40mL/min充入氧體積分數為21%的氣體混合物,反應溫度維持在30℃。

在表達一定時間后,生成的產物進入蛋白質純化柱中。經純化后,得到純化好的蛋白質產品。改變反應底物的組成,合成NbVimentin抗體、CCMV類病毒顆粒、DT5疫苗和CP抗菌肽等四種代表性的蛋白質。

在純化柱出口,取20μL蛋白質樣品,放入-80℃冷凍冰箱。

將得到的樣品解凍,進行電泳實驗,分析不同種類的蛋白質在套管膜反應單元內的表達情況,見圖2。

表1

此實施例僅為本發明較佳的具體實施方式,但本發明的保護范圍并不局限于此,任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內,可輕易想到的變化或替換,都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此,本發明的保護范圍應該以權利要求的保護范圍為準。

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